Le librerie genomiche e di cDNA rimangono strumenti essenziali per clonare geni molto estesi e per il sequenziamento su larga scala; tuttavia, per numerose applicazioni il ricorso alla reazione a catena della polimerasi (PCR, Polymerase Chain Reaction) ha reso l’amplificazione e il clonaggio di regioni definite di DNA più rapide e operative in provetta. Introdotta alla fine del XX secolo, la PCR ha trasformato l’analisi degli acidi nucleici consentendo la replicazione mirata e selettiva di un segmento specifico di DNA, con un incremento esponenziale del numero di copie nel giro di un’ora circa, senza l’uso di cellule batteriche.

La PCR sfrutta la complementarietà delle basi per dirigere una DNA polimerasi verso la regione bersaglio definita da due primer sintetici. Il requisito principale è la conoscenza, almeno parziale, della sequenza del bersaglio per progettare i primer; grazie ai repertori genomici oggi disponibili in banche dati pubbliche, tale vincolo è raramente limitante. L’alta sensibilità della PCR permette di rivelare quantità minime di DNA, ad esempio tracce in un campione ambientale o clinico, rendendola utile oltre il clonaggio: dalla diagnostica molecolare alla sorveglianza epidemiologica fino alla medicina forense.

La PCR si fonda su due proprietà: la specificità di ibridazione dei primer al loro stampo e la capacità di una DNA polimerasi termostabile di estendere un filamento a partire da un’estremità 3′-OH. I primer, brevi oligonucleotidi a singolo filamento, definiscono i confini dell’amplicone e forniscono l’estremità 3′ necessaria all’enzima per iniziare la sintesi. Progettati sulla base della sequenza bersaglio e sintetizzati chimicamente, i primer fungono sia da inneschi sia da “indirizzi” che guidano l’enzima verso la porzione di DNA da amplificare.

La reazione procede per cicli ripetuti di tre fasi, realizzati in un termociclatore:

• denaturazione, separazione dei due filamenti del DNA stampo a temperatura elevata, tipicamente ~94–98 °C;
• appaiamento dei primer (annealing), con ibridazione dei primer alle regioni complementari a una temperatura dipendente dalla loro temperatura di melting, in genere ~50–65 °C;
• estensione, durante la quale la DNA polimerasi sintetizza nuovo DNA a partire dai primer, spesso a ~72 °C per enzimi derivati da Thermus aquaticus.

All’inizio di ogni ciclo i filamenti del DNA stampo vengono separati e ciascun primer si appaia alla sequenza complementare; la polimerasi poi estende da ciascun primer in direzione 5′→3′ (Figura 04.08-01). Le molecole neo-sintetizzate diventano a loro volta stampi per i cicli successivi, determinando un aumento esponenziale delle copie (Figura 04.08-02). In condizioni ideali, dopo n cicli il numero teorico di molecole è descritto da \( N = N_0 \cdot 2^{n} \), dove \(N_0\) è il numero iniziale di copie. Per esempio, partendo da 30 copie e dopo 25 cicli, il numero atteso, in assenza di inefficienze, è \(30 \cdot 2^{25}\), pari a oltre 1,0 \times 10^9 copie.

La scelta della polimerasi è cruciale: Taq DNA polimerasi offre rapidità ma non possiede attività correttiva 3′→5′, mentre enzimi ad alta fedeltà (per esempio Pfu o Phusion) riducono gli errori grazie al proofreading, risultando preferibili quando il prodotto deve essere clonato ed espresso. Parametri come concentrazione di Mg²⁺, purezza dei dNTP, temperatura e durata di annealing/estensione influenzano selettività ed efficienza; design dei primer (18–25 nucleotidi, contenuto GC ~40–60 %, assenza di dimeri e hairpin stabili) e numero di cicli modulano la qualità dell’amplificazione.

La PCR è particolarmente adatta a frammenti inferiori a 10 000 coppie di basi; approcci “long-range” con polimerasi ottimizzate possono estendere questo limite, ma con maggiore attenzione alle condizioni di reazione. Lo stampo può essere DNA genomico o plasmidico; quando il punto di partenza è RNA, una trascrittasi inversa converte l’mRNA in cDNA, che diventa il substrato per la PCR, consentendo di ottenere l’amplicone privo di introni (Figura 04.08-03).

Un vantaggio sostanziale è la possibilità di generare direttamente un frammento clonabile a partire da campioni complessi senza costruire previamente una libreria. Per facilitare l’inserimento in vettori, i primer possono includere al 5′ siti di restrizione o sequenze di ricombinazione; inoltre, la natura delle estremità dipende dall’enzima impiegato (ad esempio, Taq aggiunge frequentemente un’adenina in 3′, utile per il “TA cloning”).

Per ridurre falsi positivi dovuti a contaminazioni, si adottano buone pratiche di laboratorio e, quando opportuno, sistemi con dUTP/uracil-DNA glicosilasi per degradare carry-over di prodotti precedenti. Questi accorgimenti preservano la specificità che è alla base dell’efficacia della tecnica.

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PCR e primer sintetici

Nella PCR una coppia di primer sintetici dirige l’amplificazione del segmento di DNA prescelto in provetta. Ogni ciclo di PCR prevede tre fasi. (1) La doppia elica di DNA viene riscaldata brevemente per separare i due filamenti. (2) Il DNA è in presenza di una quantità in eccesso di una coppia di primer specifici, progettati per delimitare la regione di DNA da amplificare, e il campione viene raffreddato per permettere ai primer di ibridare le sequenze complementari presenti sui due filamenti del DNA. (3) La miscela viene incubata con la DNA polimerasi e con i quattro deossiribonucleosidi trifosfato, in modo che il DNA venga sintetizzato a partire dai due primer. Quindi, il ciclo ricomincia con il riscaldamento per separare i filamenti di DNA di nuova sintesi. La tecnica si basa sull’impiego di una DNA polimerasi particolare, isolata da un batterio termofilo; questa polimerasi è stabile a temperature molto più alte di quelle tollerate dalle polimerasi degli eucarioti, cosicché non si denatura durante il riscaldamento della fase 1. Pertanto non è necessario aggiungere l’enzima dopo ogni ciclo.

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Tecnica della PCR

La tecnica della PCR per amplificare il DNA si basa su cicli ripetuti di separazione dei filamenti, ibridazione e sintesi. Ripetendo più e più volte il procedimento, i frammenti di DNA neosintetizzati servono a loro volta da stampo. Poiché le polimerasi e i primer rimangono nel campione dopo ogni primo ciclo, la PCR prevede semplicemente il continuo riscaldamento e raffreddamento dello stesso campione nella stessa provetta. A ogni ciclo, la quantità di DNA sintetizzata nel ciclo precedente raddoppia e, dopo pochissimi cicli, il DNA predominante diventa identico alla sequenza delimitata dai due primer nello stampo originario, primer inclusi. Nell’esempio illustrato, dopo tre cicli di reazione sono state prodotte 16 catene di DNA, 8 delle quali corrispondono esattamente all’uno o all’altro filamento della sequenza originaria delimitata dai primer. Dopo altri quattro cicli, 240 delle 256 catene di DNA corrispondono esattamente alla sequenza originaria e, dopo numerosi altri cicli, praticamente tutti i filamenti di DNA avranno quest’unica lunghezza.

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PCR per ottenere cloni genomici e cloni di cDNA

La PCR può essere usata per ottenere cloni genomici o cloni di cDNA. (A) Per usare la PCR per clonare un segmento di DNA genomico, prima di tutto bisogna purificare il DNA cromosomico dalle cellule. Poi si aggiungono come primer sintetici per la PCR le sequenze che fiancheggiano la regione di DNA che si vuole clonare e si eseguono molti cicli di PCR. Amplificando esclusivamente il DNA compreso tra i primer (primer inclusi), la PCR consente di selezionare un breve tratto di DNA cromosomico e di ottenerlo in forma praticamente pura. (B) Per ottenere un clone di cDNA di un gene con la PCR è necessario innanzitutto purificare l’mRNA dalle cellule. Si aggiunge poi il primo primer alla popolazione di mRNA e si usa la trascrittasi inversa per sintetizzare un filamento di DNA complementare alla specifica sequenza di RNA di interesse. Infine, si aggiunge il secondo primer e la molecola di DNA a singolo filamento viene amplificata mediante molti cicli di PCR.

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Oltre al clonaggio, la PCR è ampiamente impiegata per l’identificazione rapida di microrganismi patogeni, anche quando il carico infettivo è molto basso. Primer specifici per regioni del genoma di batteri, virus o parassiti consentono di rivelare poche copie virali o batteriche in campioni clinici dopo molteplici cicli di amplificazione (Figura 04.08-04). Varianti quantitative della tecnica, come la PCR in tempo reale, permettono di stimare la carica microbica e di monitorare la risposta a una terapia.

La stessa logica sostiene attività di sanità pubblica e sicurezza: la PCR contribuisce a tracciare focolai epidemici, a riconoscere precocemente agenti coinvolti in eventi bioterroristici e a controllare prodotti alimentari per la presenza di microrganismi o di componenti non dichiarate. È inoltre possibile verificare l’autenticità di ingredienti, per esempio confermando l’origine animale o vegetale di una materia prima in alimenti lavorati, o identificando adulterazioni.

In ambito forense, la straordinaria sensibilità della PCR consente la genotipizzazione a partire da quantità minime di materiale biologico, quali un singolo bulbo pilifero o cellule epiteliali su un oggetto. L’analisi di loci altamente polimorfici, tipicamente brevi ripetizioni in tandem (STR), mediante multiplex PCR produce un profilo unico della persona cui appartiene il DNA, esclusi i gemelli monozigoti (Figura 04.08-05). L’informazione così ottenuta è utilizzabile per associare campioni a individui, per escludere sospettati o per identificare vittime, nel rispetto di rigorosi standard di qualità e catena di custodia.

Per garantire l’affidabilità dei risultati in diagnostica e forense, si impiegano controlli di processo (controlli negativi e positivi), standard di riferimento e protocolli validati. La combinazione di sensibilità, rapidità e specificità rende la PCR uno strumento di prima scelta quando è necessario amplificare e caratterizzare sequenze definite di DNA con precisione e tempestività.

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PCR per rivelare un genoma virale

La PCR, capace di amplificare enormemente il segnale di ogni singola molecola di acido nucleico, è un metodo sensibilissimo per rivelare tracce di virus, senza bisogno di purificarli, in un campione di sangue o di tessuto. Nel caso dell’HIV, il virus responsabile dell’AIDS, il genoma è una molecola di RNA a singolo filamento. Oltre all’HIV, oggi questa tecnica viene applicata per rivelare molti altri virus che infettano l’organismo umano.

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Scienza forense e PCR

La scienza forense applica la PCR per distinguere una persona da un’altra. Le sequenze analizzate sono STR (Short Tandem Repeat), cioè serie di ripetizioni brevi a due a due (in tandem), quali CACACA… oppure GTGTGT…, che si trovano in varie posizioni (loci) del genoma umano. Negli esseri umani il numero di ripetizioni in ogni STR varia moltissimo, da 4 a 40. Proprio per la variabilità di queste sequenze, di solito ognuno di noi eredita dalla madre e dal padre varianti diverse di ogni locus STR; per questo due persone non imparentate non presentano quasi mai la stessa coppia di sequenze in un locus STR. (A) Una reazione di PCR che utilizza dei primer che delimitano sequenze uniche su un locus STR particolare produce una coppia di bande di DNA amplificato da ogni persona: una banda che rappresenta la variante STR materna e l’altra la variante paterna. La lunghezza del DNA amplificato, e quindi la sua posizione sul gel dopo l’elettroforesi, dipendono dal numero esatto di ripetizioni presenti in quel locus. (B) Nell’esempio schematico mostrato, vengono analizzati gli stessi tre loci STR provenienti da tre persone sospettate (A, B, C) che producono sei bande per ognuna di esse. Sebbene persone diverse possano avere diverse bande in comune, quando si guarda un quadro complessivo del tutto caratteristico, il quadro di bande STR può perciò servire come impronta di DNA (DNA fingerprint) per identificare qualcuno in maniera pressoché inequivocabile. La quarta corsia (F) contiene il prodotto delle stesse amplificazioni PCR condotte su un ipotetico campione di DNA proveniente da una perizia forense, che potrebbe essere stato ottenuto da un capello o da una piccola traccia di sangue lasciata sulla scena del crimine. Quanto più numerosi sono i loci esaminati, tanto più possiamo essere sicuri del risultato. Esaminando le varianti relative a 5-10 loci STR diversi, la probabilità che due persone a caso abbiano la stessa impronta è approssimativamente una su 10 miliardi. Nel caso esemplificato qui, A e C possono essere esclusi dalle indagini, mentre B no. Un approccio simile viene oggi utilizzato di routine per i test di paternità.

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