Già alla fine degli anni ’50 era chiaro che il flusso dell’informazione biologica procede dal DNA all’RNA e, successivamente, alle proteine. Il nucleo della discussione si spostò allora sul “codice”: con quali regole una stringa di nucleotidi nell’RNA viene tradotta in una sequenza ordinata di amminoacidi, chimicamente eterogenei rispetto agli acidi nucleici? La questione, al crocevia tra biologia, fisica, matematica e chimica, fu spesso paragonata alla decifrazione di un cifrario prodotto dall’evoluzione. Nel giro di pochi anni furono rivelate sia la tabella di corrispondenza tra triplette e amminoacidi, sia l’architettura dei complessi molecolari che, nelle cellule, eseguono con precisione la lettura e la traduzione del messaggio genetico.

La trascrizione è concettualmente un trasferimento fedele di informazione tra polimeri affini: DNA e RNA condividono logica di appaiamento e chimica di base, per cui l’uno può fungere da stampo per l’altro. La traduzione è invece una vera conversione di linguaggio: la sequenza a quattro simboli dell’mRNA deve essere interpretata in termini della ventina di amminoacidi presenti nelle proteine, rendendo impossibile una corrispondenza uno-a-uno tra nucleotide e amminoacido. Le regole di corrispondenza tra motivi nucleotidici e amminoacidi costituiscono il codice genetico.

Nel 1961 fu dimostrato che il messaggio è segmentato in unità di tre nucleotidi consecutivi, dette codoni. Poiché l’RNA ha quattro basi, il numero di combinazioni possibili è \(4^3 = 64\). A fronte di 20 amminoacidi proteici, ne consegue che il codice è degenerato: più codoni sinonimi specificano lo stesso amminoacido, come illustrato nella (Figura 03.06-01). Il codice è inoltre non ambiguo (ogni codone specifica un solo amminoacido o uno stop), privo di virgole o segni di punteggiatura interni e letto senza sovrapposizioni.

La quasi universalità del codice è una delle evidenze più forti della comune origine degli organismi: lievi varianti sono state documentate soprattutto nell’mRNA mitocondriale, in alcuni funghi e in alcuni protozoi, ma le corrispondenze condivise prevalgono nettamente. I mitocondri, dotati di apparati di replicazione, trascrizione e traduzione parzialmente autonomi, presentano riassetti puntuali mantenendo però la compatibilità complessiva con il codice “standard”.

La traduzione dipende anche dalla scelta del corretto modulo di lettura: su una stessa sequenza di mRNA possono coesistere tre possibili frame, a seconda del nucleotide di inizio (Figura 03.06-02). Nella pratica cellulare, solo un frame conduce alla proteina funzionale grazie a segnali molecolari che definiscono il sito di avvio (per esempio, AUG come codone di start nella maggior parte dei contesti) e a sequenze nel 5′ UTR che guidano il posizionamento del ribosoma. Codoni di stop (UAA, UAG, UGA) marcano la terminazione della catena polipeptidica:

• Il codice genetico utilizza triplette non sovrapposte di nucleotidi letti in successione senza interpunzioni;
• È degenerato ma non ambiguo: codoni diversi possono specificare lo stesso amminoacido, ma ciascun codone ha un solo significato;
• È quasi universale, con scostamenti circoscritti nei mitocondri e in pochi eucarioti unicellulari;
• La corretta scelta del frame di lettura dipende da segnali d’inizio e dal riconoscimento ribosomiale dell’mRNA.

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Codice genetico e traduzione

La sequenza nucleotidica dell’mRNA viene tradotta nella sequenza amminoacidica di una proteina in base al codice genetico. Ogni amminoacido è qui riportato con le sue abbreviazioni convenzionali a una e a tre lettere e indicato sotto tutti i codoni a tre nucleotidi che lo specificano. Come per le molecole di RNA, i codoni sono scritti sempre con l’estremità 5′ a sinistra. Si noti che quasi tutti gli amminoacidi corrispondono a più di un codone e che i gruppi di codoni che codificano lo stesso amminoacido hanno alcune proprietà ricorrenti. I codoni per lo stesso amminoacido tendono infatti a presentare gli stessi nucleotidi in prima e seconda posizione, variando solo in terza posizione. Esistono tre codoni che non specificano alcun amminoacido, ma agiscono da terminatori (codoni di stop o di terminazione), segnalando la fine della sequenza che codifica la proteina in un mRNA. Uno dei codoni, AUG, fa sia da codone iniziatore, perché segnala l’inizio di un messaggio codificante, sia da codone per la metionina.

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Moduli di lettura dell’mRNA

In linea di principio, una molecola di mRNA è traducibile in tre modi diversi, a seconda del modulo di lettura. Nel processo di traduzione di una sequenza nucleotidica (in blu) in una sequenza amminoacidica (in rosso), la sequenza di nucleotidi di una molecola di mRNA viene letta dall’estremità 5′ a quella 3′ in gruppi consecutivi di tre nucleotidi ciascuno. Perciò, la stessa sequenza di mRNA potrebbe specificare tre sequenze amminoacidiche completamente diverse, a seconda di dove inizia la traduzione, ovvero a seconda del modulo di lettura utilizzato. Tuttavia, di fatto, solo uno di questi moduli codifica il messaggio corretto e viene utilizzato nella traduzione, come vedremo in seguito.

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I codoni dell’mRNA non interagiscono direttamente con gli amminoacidi. L’accoppiamento è mediato da adattatori molecolari, i transfer RNA (tRNA), piccoli RNA di circa 70–95 nucleotidi che assumono una struttura tridimensionale caratteristica. Ampie regioni interne appaiate stabilizzano una conformazione a “trifoglio” nello schema bidimensionale (Figura 03.06-03) che, per ripiegamento ulteriore e stacking elicoidale, genera un corpo a forma di L compatta (Figura 03.06-03). Tale architettura è assistita da numerose basi modificate (per esempio pseudouridina e diidrouridina) che ottimizzano stabilità e riconoscimento.

Due elementi topologicamente opposti definiscono la funzione del tRNA: il loop dell’anticodone, che espone tre nucleotidi in grado di appaiarsi in modo complementare al codone dell’mRNA (Figura 03.06-03), e il braccio accettore all’estremità 3′, terminante in 3′-CCA, sito di legame covalente dell’amminoacido corrispondente. Il riconoscimento codonico avviene nel sito A del ribosoma, dove la complementarità tra anticodone e codone è verificata con elevata stringenza.

La degenerazione del codice è resa possibile anche dalla flessibilità dell’appaiamento nella terza posizione del codone, la cosiddetta “wobble” descritta da Crick. Alcuni tRNA, grazie a basi modificate come l’inosina in posizione 34 dell’anticodone, possono riconoscere più codoni che differiscono al terzo nucleotide, riducendo il numero minimo di tRNA necessari per leggere i 61 codoni senso a circa 31. Nella pratica, molte specie possiedono famiglie di tRNA più ampie: nell’uomo si contano oltre 500 geni nucleari per tRNA che danno luogo a circa 48–50 anticodoni distinti, con isoaccettori specifici per lo stesso amminoacido:

• Struttura modulare: braccio accettore 3′-CCA, loop dell’anticodone, loop D e loop TψC con basi modificate;
• Conformazione tridimensionale a L che posiziona a distanza fissa il gruppo amminoacilico e il tripletto dell’anticodone;
• Capacità di riconoscere codoni sinonimi mediante appaiamento “wobble” nella terza base;
• Famiglie di tRNA (isoaccettori) che condividono l’amminoacido ma differiscono nell’anticodone.

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Molecole di tRNA come adattatori

Le molecole di tRNA sono adattatori molecolari che fanno corrispondere ogni amminoacido al suo codone. In questa serie di disegni schematici viene rappresentata la stessa molecola di tRNA, in questo caso il tRNA specifico per l’amminoacido fenilalanina (Phe). (A) Struttura a trifoglio, convenzionalmente usata per evidenziare l’appaiamento delle basi complementari (trattini rossi), che dà origine a regioni a doppia elica nella molecola. L’anticodone (in blu) è la sequenza di tre nucleotidi (lettere rosse) che si appaia con il codone Phe dell’mRNA. L’amminoacido che corrisponde all’anticodone è attaccato all’estremità 3′ del tRNA. I tRNA contengono alcune basi poco frequenti, prodotte per modifica chimica dopo che il tRNA è già stato sintetizzato. Esse derivano dall’uracile e sono indicate con Y (la lettera greca psi, per pseudouridina) e D (per diidrouridina). (B e C) Proiezioni della molecola a forma di L, basate sull’analisi di diffrazione dei raggi X. Queste due immagini sono ruotate di 90° l’una rispetto all’altra. (D) Rappresentazione schematica del tRNA in cui è evidenziato l’anticodone utilizzato nelle figure seguenti. (E) Sequenza nucleotidica lineare della molecola di tRNA, dove alcuni tratti sono evidenziati con colori corrispondenti per facilitare il riconoscimento nelle rappresentazioni (A), (B) e (C).

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Molecole di tRNA come adattatori

Le molecole di tRNA sono adattatori molecolari che fanno corrispondere ogni amminoacido al suo codone. In questa serie di disegni schematici viene rappresentata la stessa molecola di tRNA, in questo caso il tRNA specifico per l’amminoacido fenilalanina (Phe). (A) Struttura a trifoglio, convenzionalmente usata per evidenziare l’appaiamento delle basi complementari (trattini rossi), che dà origine a regioni a doppia elica nella molecola. L’anticodone (in blu) è la sequenza di tre nucleotidi (lettere rosse) che si appaia con il codone Phe dell’mRNA. L’amminoacido che corrisponde all’anticodone è attaccato all’estremità 3′ del tRNA. I tRNA contengono alcune basi poco frequenti, prodotte per modifica chimica dopo che il tRNA è già stato sintetizzato. Esse derivano dall’uracile e sono indicate con Y (la lettera greca psi, per pseudouridina) e D (per diidrouridina). (B e C) Proiezioni della molecola a forma di L, basate sull’analisi di diffrazione dei raggi X. Queste due immagini sono ruotate di 90° l’una rispetto all’altra. (D) Rappresentazione schematica del tRNA in cui è evidenziato l’anticodone utilizzato nelle figure seguenti. (E) Sequenza nucleotidica lineare della molecola di tRNA, dove alcuni tratti sono evidenziati con colori corrispondenti per facilitare il riconoscimento nelle rappresentazioni (A), (B) e (C).

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Molecole di tRNA come adattatori

Le molecole di tRNA sono adattatori molecolari che fanno corrispondere ogni amminoacido al suo codone. In questa serie di disegni schematici viene rappresentata la stessa molecola di tRNA, in questo caso il tRNA specifico per l’amminoacido fenilalanina (Phe). (A) Struttura a trifoglio, convenzionalmente usata per evidenziare l’appaiamento delle basi complementari (trattini rossi), che dà origine a regioni a doppia elica nella molecola. L’anticodone (in blu) è la sequenza di tre nucleotidi (lettere rosse) che si appaia con il codone Phe dell’mRNA. L’amminoacido che corrisponde all’anticodone è attaccato all’estremità 3′ del tRNA. I tRNA contengono alcune basi poco frequenti, prodotte per modifica chimica dopo che il tRNA è già stato sintetizzato. Esse derivano dall’uracile e sono indicate con Y (la lettera greca psi, per pseudouridina) e D (per diidrouridina). (B e C) Proiezioni della molecola a forma di L, basate sull’analisi di diffrazione dei raggi X. Queste due immagini sono ruotate di 90° l’una rispetto all’altra. (D) Rappresentazione schematica del tRNA in cui è evidenziato l’anticodone utilizzato nelle figure seguenti. (E) Sequenza nucleotidica lineare della molecola di tRNA, dove alcuni tratti sono evidenziati con colori corrispondenti per facilitare il riconoscimento nelle rappresentazioni (A), (B) e (C).

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Affinché il tRNA funzioni da adattatore, deve essere “caricato” con l’amminoacido appropriato. Questa reazione è catalizzata da enzimi altamente specifici, le amminoacil‑tRNA sintetasi. In genere esiste una sintetasi per ciascuno dei 20 amminoacidi proteici. Ciascuna riconosce tutti i tRNA che trasportano quello specifico amminoacido (isoaccettori), distinguendoli sulla base di elementi di identità distribuiti nell’anticodone e nel braccio accettore, nonché in regioni accessorie della struttura secondaria (Figura 03.06-04).

L’amminoacilazione procede in due stadi accoppiati all’idrolisi di ATP, con conservazione dell’energia nel legame estere ad alta energia tra amminoacido e tRNA:

\[ \begin{aligned} \text{AA} + \text{ATP} &\rightarrow \text{AA\text{-}AMP} + \text{PP}_\text{i};\\ \text{AA\text{-}AMP} + \text{tRNA} &\rightarrow \text{AA\text{-}tRNA} + \text{AMP}. \end{aligned} \]

L’idrolisi del pirofosfato spinge la reazione verso destra. L’energia immagazzinata nell’amminoacil‑tRNA è poi utilizzata, sul ribosoma, per la formazione del legame peptidico con la catena nascente. Le sintetasi integrano spesso meccanismi di proofreading (pre‑ e post‑transfer editing) che scartano amminoacidi o prodotti errati, aumentando drasticamente la fedeltà globale della traduzione.

La correttezza della decodifica dipende dall’azione congiunta di tRNA e sintetasi: solo se il tRNA giusto porta l’amminoacido giusto, il codone dell’mRNA viene interpretato in modo coerente con il codice genetico (Figura 03.06-05). Ad esempio, i quattro codoni GGU/GGC/GGA/GGG, tutti sinonimi per glicina, sono riconosciuti da uno o più tRNA^Gly le cui forme anticodoniche, anche grazie al wobble, coprono l’intero set, mentre la glicil‑tRNA sintetasi garantisce che soltanto la glicina venga esterificata all’estremità 3′ dei relativi tRNA:

• Una sintetasi per ciascun amminoacido proteico, capace di riconoscere i rispettivi tRNA isoaccettori;
• Meccanismo in due tappe con intermedio amminoacil‑AMP e consumo di ATP;
• Elementi di identità nel tRNA distribuiti in anticodone, braccio accettore e loop strutturali;
• Editing chimico che corregge errori di attivazione e trasferimento, assicurando elevata fedeltà complessiva.

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Riconoscimento del tRNA da parte della sintetasi

Ogni amminoacil-tRNA sintetasi stabilisce contatti multipli con la sua molecola di tRNA. Per questo tRNA, che è specifico per l’amminoacido glutammina, i nucleotidi sia nell’asola (loop) dell’anticodone (in blu scuro) sia nel braccio accettore dell’amminoacido (in verde) sono riconosciuti dalla sintetasi (in giallo-verde). La molecola di ATP idrolizzata per fornire l’energia necessaria ad attaccare l’amminoacido al tRNA è mostrata in rosso.

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Traduzione del codice genetico tramite tRNA e sintetasi

Il codice genetico si traduce per mezzo delle amminoacil-tRNA sintetasi e del tRNA. Ogni sintetasi carica un particolare amminoacido sul suo tRNA corrispondente, un processo chiamato carica. L’anticodone sulla molecola di tRNA carica il codone complementare sull’mRNA per appaiamento di basi. Ogni errore in una qualsiasi delle due fasi, la carica del tRNA o l’appaiamento del tRNA carico al suo codone, porta all’incorporazione di un amminoacido sbagliato nella catena proteica. Nella sequenza di eventi qui illustrata, l’amminoacido triptofano (Trp) viene scelto dal codone UGG sull’RNA messaggero.

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L’appaiamento tra codone e anticodone, mediato da legami a idrogeno tra basi complementari, segue gli stessi principi chimici che regolano replicazione e trascrizione del DNA, con una tolleranza limitata al “wobble” nella terza posizione del codone. La conversione rapida e fedele della sequenza nucleotidica in una sequenza amminoacidica, tuttavia, richiede un apparato ribonucleoproteico di grandi dimensioni capace di scorrere lungo l’mRNA, selezionare i tRNA corretti e orchestrare la formazione dei legami peptidici.

Questo apparato è il ribosoma, presente in quantità molto elevate nel citoplasma (milioni di copie in una cellula eucariotica tipica) (Figura 03.06-06). I ribosomi batterici e quelli eucariotici condividono un’architettura conservata: una subunità piccola deputata alla decodifica e una subunità grande che catalizza la formazione del legame peptidico, che si associano in un complesso di diversi milioni di dalton (Figura 03.06-07). In termini sedimentazionali, i ribosomi batterici sono 70S (30S + 50S), mentre quelli eucariotici sono 80S (40S + 60S). La subunità piccola riconosce i codoni dell’mRNA e li accoppia ai tRNA corrispondenti; la subunità grande ospita il centro di peptidil transferasi e guida l’allungamento della catena polipeptidica.

La traduzione inizia in prossimità dell’estremità 5′ dell’mRNA, cui le subunità si associano in modo dipendente dai fattori d’inizio; il ribosoma procede quindi lungo l’mRNA in direzione 5′→3′, decodificando un codone alla volta e aggiungendo gli amminoacidi alla estremità carbossilica della proteina in crescita. La catena polipeptidica, di conseguenza, si allunga dal terminus amminico verso il terminus carbossilico. Per assicurare il corretto flusso delle reazioni, il ribosoma dispone di tre siti di legame per i tRNA: A (aminoacil), P (peptidil) ed E (exit), disposti in un canale che attraversa entrambe le subunità (Figura 03.06-08).

Il ciclo di allungamento si articola in passaggi coordinati e ripetitivi (Figura 03.06-09):

• selezione del tRNA: un tRNA carico viene accompagnato al sito A da un fattore GTPasico (EF-Tu nei batteri, eEF1A negli eucarioti) e accettato solo se l’appaiamento codone–anticodone è corretto, evento che innesca l’idrolisi di GTP e blocca il tRNA nel sito A;
• formazione del legame peptidico: il gruppo carbossilico della catena peptidil-tRNA nel sito P reagisce con il gruppo amminico dell’amminoacil-tRNA nel sito A, trasferendo l’intera catena al tRNA del sito A;
• traslocazione: un secondo fattore GTPasico (EF-G nei batteri, eEF2 negli eucarioti) promuove lo scorrimento coordinato dell’mRNA di un codone e il “ratcheting” delle subunità; il tRNA scarico raggiunge il sito E, mentre il peptidil-tRNA si posiziona nel sito P;
• uscita: il tRNA deacilato lascia il sito E e un nuovo amminoacil-tRNA entra nel sito A, ripetendo il ciclo.

Questo meccanismo è altamente efficiente: nei batteri la velocità tipica è di circa 20 amminoacidi al secondo, mentre nelle cellule eucariotiche è inferiore, intorno a 2–8 residui al secondo, in accordo con il dato di ~2 residui s⁻¹ citato per molte linee cellulari. L’accuratezza è assicurata da un sistema di “decoding” a due stadi e dal proofreading cinetico, che sfrutta l’idrolisi di GTP per penalizzare appaiamenti errati. Più ribosomi possono impegnare simultaneamente la stessa molecola di mRNA formando polisomi, incrementando la resa proteica senza aumentare la trascrizione.

La sintesi termina quando nel sito A compare un codone di stop; fattori di rilascio specifici riconoscono questi codoni e promuovono l’idrolisi del legame estere che ancora la catena polipeptidica al tRNA, liberando la proteina. Successivamente, le subunità ribosomiali si dissociano e sono riciclate per nuovi cicli traduttivi.

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Ribosomi nelle cellule eucariote

I ribosomi delle cellule eucariote si trovano nel citoplasma. Questa fotografia al microscopio elettronico mostra una sezione ultrasottile di una piccola regione del citoplasma. I ribosomi si presentano come puntini grigi; alcuni sono liberi nel citoplasma (frecce rosse), altri sono attaccati alle membrane del reticolo endoplasmatico (frecce verdi). [Per gentile concessione di George Palade]

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Ribosoma eucariote

Il ribosoma eucariote è un aggregato enorme, formato da quattro RNA e oltre 80 proteine. Il ribosoma procariote è costituito da due subunità, una più grande e una più piccola, che si uniscono una volta stabilito il legame tra la subunità minore e l’mRNA. Gli RNA rappresentano la maggior parte della massa del ribosoma, a cui conferiscono forma e struttura.

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Siti di legame del ribosoma

Ogni ribosoma presenta un sito di legame per l’mRNA e tre siti di legame per il tRNA. I siti per il tRNA sono indicati con le lettere A, P ed E, rispettivamente abbreviazioni per amminoacil-tRNA, peptidil-tRNA e uscita (exit). (A) Struttura tridimensionale di un ribosoma batterico, determinata con la cristallografia a raggi X, con la subunità minore in verde scuro e la subunità maggiore in verde chiaro. Sia gli rRNA sia le proteine ribosomiali sono mostrati in verde. Il modello illustra i tRNA legati al sito E (in rosso), al sito P (in arancione) e al sito A (in giallo). Anche se qui si vede un tRNA per ogni sito, durante il processo della sintesi proteica solo due siti sono occupati in contemporanea da molecole di tRNA (Figura 7.37). (B) Rappresentazione molto schematica del ribosoma, orientato come in (A), utilizzato nelle figure successive. Si noti che sia la subunità maggiore sia la subunità minore sono coinvolte nella creazione dei siti A, P ed E, mentre solo la subunità minore forma il sito di legame per un mRNA.

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Ciclo della traduzione proteica

La traduzione avviene in un processo ciclico a quattro stadi, il quale viene ripetuto più volte durante la sintesi di una proteina.

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Il ribosoma è tra i complessi macromolecolari più imponenti della cellula e, per massa, è composto in larga parte da RNA (circa due terzi) e per il rimanente da proteine. La determinazione ad alta risoluzione della struttura delle sue subunità, ottenuta all’inizio degli anni 2000 mediante cristallografia a raggi X e, successivamente, perfezionata con la crio-microscopia elettronica, ha consolidato un risultato fondamentale: l’impalcatura e la funzione catalitica chiave del ribosoma risiedono nell’RNA ribosomiale (rRNA), non nelle proteine.

Gli rRNA si ripiegano in una conformazione tridimensionale ampia e articolata che costituisce il nucleo del complesso (Figura 03.06-10). Le proteine ribosomiali sono disposte prevalentemente alla periferia, dove colmano solchi e cavità dell’RNA, stabilizzandone il ripiegamento, accelerandone l’assemblaggio e modulando i movimenti conformazionali necessari alle diverse fasi della traduzione. I tre siti per i tRNA (A, P ed E) sono formati quasi interamente da rRNA e il centro catalitico di peptidil transferasi è localizzato nel dominio dell’rRNA della subunità maggiore (23S nei batteri; 28S negli eucarioti). Misure strutturali hanno mostrato che nessuna proteina si avvicina a sufficienza da poter partecipare direttamente alla catalisi del legame peptidico.

Il centro di peptidil transferasi presenta una tasca che orienta in modo preciso le estremità 3′-CCA dei due tRNA reagenti: tale orientamento riduce la barriera entropica e favorisce l’attacco nucleofilo del gruppo amminico dell’amminoacil-tRNA sul carbonile del peptidil-tRNA. Evidenze biochimiche indicano che il gruppo 2′-OH dell’A76 del tRNA nel sito P facilita il trasferimento protonico durante la reazione, fungendo da “shuttle” catalitico. I cationi (ad esempio Mg²⁺) e la parziale esclusione di acqua dal sito reattivo contribuiscono alla stabilizzazione dello stato di transizione. Questa strategia, definita spesso catalisi per orientamento e posizionamento, condivide principi con gli enzimi proteici pur essendo realizzata da RNA.

La subunità piccola, tramite specifiche basi dell’rRNA (il “decoding center”), verifica la geometria dell’appaiamento codone–anticodone e, con movimenti locali, amplifica le differenze tra coppie corrette e scorrette; tali cambi conformazionali sono accoppiati all’attività GTPasica dei fattori di allungamento, migliorando l’accuratezza complessiva. Strutture mobili come lo “stelo L1” della subunità maggiore partecipano alla liberazione del tRNA dal sito E, mentre il braccio L7/L12 (o il suo equivalente eucariotico) recluta e attiva i fattori.

Poiché l’elemento catalitico è l’RNA, il ribosoma è a tutti gli effetti un ribozima. Insieme ad altri esempi di catalisi mediata da RNA, quali introni auto-splicing e RNasi P, esso sostiene l’ipotesi che, nelle prime fasi dell’evoluzione, molecole di RNA abbiano svolto ruoli sia informazionali sia enzimatici. Il nucleo a RNA del ribosoma può quindi essere considerato una traccia molecolare di un’antica fase “a RNA” della vita, in cui la funzione catalitica non dipendeva ancora da proteine specializzate.

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RNA ribosomiali e conformazione del ribosoma

Gli RNA ribosomiali conferiscono al ribosoma la sua conformazione di base. La figura rappresenta i modelli dettagliati dei due RNA ribosomiali, l’rRNA 23S (in blu) e l’rRNA 5S (in viola), che formano il nucleo centrale della subunità maggiore nel ribosoma batterico. Per dare un’idea delle dimensioni relative dei componenti del ribosoma, è riportata nella figura anche L1, una delle subunità proteiche che forma una sporgenza caratteristica sulla superficie del ribosoma. Gli RNA ribosomiali si distinguono di solito per il loro “valore S”, che esprime la velocità di sedimentazione nell’ultracentrifuga. Maggiore è il valore S, più grande è la molecola.

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Nell’ambiente cellulare, la traduzione non può cominciare in un punto qualsiasi dell’mRNA: è indispensabile un segnale di avvio che imposti correttamente la cornice di lettura. La scelta del nucleotide di partenza determina l’allineamento dei triplette successive; uno slittamento di +1 o −1 nucleotide altera l’intero messaggio, generando una sequenza amminoacidica incoerente e, in genere, inattiva (Figura 03.06-02). Inoltre, la frequenza con cui si formano complessi di inizio condiziona la produttività complessiva di un mRNA: quando l’allungamento non è limitante, il flusso di sintesi proteica approssima la costante di inizio, \(J \approx k_{\text{inizio}}\).

Il codone d’avvio tipico è AUG. L’inizio richiede un tRNA iniziatore carico, distinto dal tRNA che veicola di norma la metionina. Questo tRNA specifico porta metionina nelle cellule eucariotiche e formilmetionina nei batteri; di frequente, la metionina iniziale viene successivamente rimossa da metionina ammino–peptidasi, e nei procarioti la formilazione viene prima eliminata da una deformilasi.

Negli eucarioti, il tRNA iniziatore carico si associa direttamente al sito P della subunità ribosomiale minore in complesso con fattori di inizio (Figura 03.06-11). Tale pre-complesso riconosce l’estremità 5′ dell’mRNA grazie al cappuccio 5′ e alle proteine che lo legano (Figura 03.05-16); quindi scorre in direzione 5′→3′ alla ricerca di un AUG in un contesto favorevole (sequenza di Kozak). Una volta appaiato correttamente al codone d’inizio, l’idrolisi di GTP su specifici fattori provoca il distacco dei fattori di inizio e consente l’aggancio della subunità maggiore, completando il ribosoma. Poiché il tRNA iniziatore occupa già il sito P, la catena polipeptidica può iniziare ad allungarsi con l’ingresso nel sito A del tRNA successivo (Figura 03.06-09).

Nei batteri, il posizionamento sul codone d’inizio non dipende da un cappuccio 5′, bensì da brevi sequenze guida situate a monte degli AUG, note come siti di legame al ribosoma (consenso Shine–Dalgarno), lunghe tipicamente 4–9 nucleotidi e complementari all’rRNA 16S. Grazie a questo appaiamento, il ribosoma può iniziare anche su AUG interni a un trascritto, caratteristica cruciale perché molti mRNA batterici sono policistronici e codificano più polipeptidi indipendenti (Figura 03.06-12). Al contrario, gli mRNA eucariotici sono per lo più monocistronici e sfruttano l’interazione con il cappuccio 5′ per reclutare il ribosoma.

La terminazione avviene quando uno dei codoni di stop (UAA, UAG, UGA) raggiunge il sito A del ribosoma (Figura 03.06-01). Questi triplette non corrispondono ad alcun tRNA; sono invece riconosciute da proteine di rilascio che rimodulano il centro peptidil–transferasico, inducendo l’aggiunta di una molecola d’acqua al peptidil–tRNA e liberando così l’estremità carbossilica della catena nascente (Figura 03.06-13). Il polipeptide completo si stacca, l’mRNA viene rilasciato e le subunità ribosomiali si separano, pronte a intraprendere un nuovo ciclo di traduzione.

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Moduli di lettura dell’mRNA

In linea di principio, una molecola di mRNA è traducibile in tre modi diversi, a seconda del modulo di lettura. Nel processo di traduzione di una sequenza nucleotidica (in blu) in una sequenza amminoacidica (in rosso), la sequenza di nucleotidi di una molecola di mRNA viene letta dall’estremità 5′ a quella 3′ in gruppi consecutivi di tre nucleotidi ciascuno. Perciò, la stessa sequenza di mRNA potrebbe specificare tre sequenze amminoacidiche completamente diverse, a seconda di dove inizia la traduzione, ovvero a seconda del modulo di lettura utilizzato. Tuttavia, di fatto, solo uno di questi moduli codifica il messaggio corretto e viene utilizzato nella traduzione, come vedremo in seguito.

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Inizio della sintesi proteica negli eucarioti

Negli eucarioti l’inizio della sintesi proteica richiede la presenza di fattori di inizio e di un particolare tRNA iniziatore. Sebbene non sia mostrato qui, per svolgersi con efficienza, il processo di inizio richiede anche altre proteine legate al cappuccio 5′ e alla coda poliadenilica dell’mRNA (Figura 7.25). In questo modo l’apparato di traduzione può assicurarsi che entrambe le estremità del messaggero siano intatte prima di partire con la traduzione. Completato lo stadio di inizio, la proteina si allunga con il ciclo di reazioni delineate nella Figura 7.37.

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Modifiche dell’mRNA negli eucarioti

Negli eucarioti l’apposizione del cappuccio e la poliadenilazione modificano le molecole di mRNA. (A) Un mRNA eucariote presenta un cappuccio all’estremità 5′ e una coda di poliA in corrispondenza dell’estremità 3′. Come mostrato, oltre alle sequenze nucleotidiche che codificano per proteine, la maggior parte degli mRNA contiene sequenze extra non codificanti. La porzione non codificante all’estremità 5′ è chiamata regione non tradotta 5′ o 5′ UTR (UnTranslated Region) e quella all’estremità 3′ è chiamata 3′ UTR. (B) Struttura del cappuccio all’estremità 5′: molti mRNA presentano una modifica ulteriore negli eucarioti; il gruppo ossidrile in 2′ del secondo ribosio della molecola di mRNA è metilato (non mostrato nella figura).

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Ciclo della traduzione proteica

La traduzione avviene in un processo ciclico a quattro stadi, il quale viene ripetuto più volte durante la sintesi di una proteina.

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mRNA policistronico nei procarioti

Nei procarioti la stessa molecola di mRNA può codificare molte proteine differenti. I geni coinvolti in varie fasi dello stesso processo biochimico sono spesso organizzati in gruppi (operoni), che vengono trascritti insieme in un mRNA unico. Un mRNA procariote contiene un trifosfato all’estremità 5′, al posto del cappuccio al 5′ dell’mRNA eucariote. I ribosomi dei procarioti danno inizio alla traduzione in appositi siti di legame per il ribosoma (in blu scuro), che possono trovarsi all’interno della molecola di mRNA. Questa particolarità permette ai procarioti di sintetizzare contemporaneamente più proteine distinte a partire dalla stessa molecola di mRNA, con ogni proteina sintetizzata da un ribosoma diverso.

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Codice genetico e traduzione

La sequenza nucleotidica dell’mRNA viene tradotta nella sequenza amminoacidica di una proteina in base al codice genetico. Ogni amminoacido è qui riportato con le sue abbreviazioni convenzionali a una e a tre lettere e indicato sotto tutti i codoni a tre nucleotidi che lo specificano. Come per le molecole di RNA, i codoni sono scritti sempre con l’estremità 5′ a sinistra. Si noti che quasi tutti gli amminoacidi corrispondono a più di un codone e che i gruppi di codoni che codificano lo stesso amminoacido hanno alcune proprietà ricorrenti. I codoni per lo stesso amminoacido tendono infatti a presentare gli stessi nucleotidi in prima e seconda posizione, variando solo in terza posizione. Esistono tre codoni che non specificano alcun amminoacido, ma agiscono da terminatori (codoni di stop o di terminazione), segnalando la fine della sequenza che codifica la proteina in un mRNA. Uno dei codoni, AUG, fa sia da codone iniziatore, perché segnala l’inizio di un messaggio codificante, sia da codone per la metionina.

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Terminazione della traduzione

La traduzione si arresta in corrispondenza di un codone di stop. Durante la fase finale della sintesi proteica, la traduzione di una molecola di mRNA si arresta in seguito al legame di un fattore di rilascio al sito A su cui è presente un codone di stop. Il polipeptide completato si sgancia e il ribosoma si dissocia nelle due subunità di cui è composto.

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La formazione di una proteina può richiedere da alcune decine di secondi a vari minuti, a seconda della lunghezza della catena e della velocità di allungamento. Gli mRNA efficientemente tradotti sono occupati da più ribosomi in parallelo: appena il ribosoma che precede ha lasciato sufficiente spazio, un altro complesso d’inizio si insedia sul capo 5′. Ne risultano strutture chiamate poliribosomi o polisomi, aggregati in cui numerosi ribosomi avanzano sullo stesso mRNA, tipicamente distanziati di almeno 80 nucleotidi per evitare interferenze steriche (Figura 03.06-14). La traduzione simultanea di più copie della proteina a partire da una singola molecola di mRNA accresce notevolmente la resa nell’unità di tempo.

Polisomi si formano sia nei procarioti sia negli eucarioti. Nei batteri, la vicinanza fisica tra trascrizione e traduzione introduce un ulteriore vantaggio: poiché l’mRNA non necessita di maturazione ed è subito accessibile, i ribosomi si agganciano all’estremità nascente del trascritto e iniziano a tradurre mentre l’RNA polimerasi sta ancora procedendo lungo il DNA. Negli eucarioti, il legame coordinato tra cappuccio 5′ e coda poli(A), mediato da proteine che favoriscono la “circolarizzazione” funzionale dell’mRNA, facilita il riciclo dei ribosomi e sostiene l’elevata efficienza del processo.

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Poliribosomi

Le proteine vengono sintetizzate dai poliribosomi. (A) Schema da cui si deduce che una serie di ribosomi può tradurre simultaneamente la stessa molecola di mRNA. (B) Poliribosoma nel citoplasma di una cellula eucariote al microscopio elettronico.

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La traduzione accurata dell’informazione genetica è essenziale in ogni cellula. Nonostante l’architettura dei ribosomi sia altamente conservata, differenze mirate tra apparati procariotici ed eucariotici sono sufficienti per essere sfruttate farmacologicamente. Numerosi antibiotici interferiscono selettivamente con la sintesi proteica dei batteri senza inibire in modo significativo quella degli eucarioti, permettendo l’uso clinico a dosi efficaci.

Questi composti si legano a siti distinti del ribosoma procariotico e bloccano fasi differenti della traduzione; esempi rappresentativi sono riportati nella (Tabella 03.06-01). In linea generale, si osservano meccanismi d’azione ricorrenti:

• impedimento dell’ingresso o del corretto posizionamento dei tRNA nel sito A, come per diverse tetracicline;
• inibizione dell’attività peptidil–transferasica o del passaggio della catena attraverso il canale di uscita, come per cloramfenicolo e macrolidi;
• alterazione della selezione dei codoni e dell’accuratezza di lettura, con aumento di errori di appaiamento, come per alcuni aminoglicosidi;
• blocco dell’inizio o del riciclo ribosomiale dovuto al legame con componenti specifiche delle subunità minore o maggiore.

Molti antibiotici sono stati isolati originariamente da funghi, che competono con i batteri nelle stesse nicchie ecologiche. Poiché funghi e umani sono entrambi eucarioti, tali molecole risultano spesso selettive verso i batteri. Va notato che l’affinità parziale di alcuni farmaci per ribosomi simili a quelli batterici, come quelli mitocondriali, spiega talune tossicità d’organo. L’emergere di resistenze batteriche mediante modifiche del bersaglio, pompe di efflusso o inattivazione enzimatica impone un aggiornamento continuo dell’arsenale terapeutico.

Dopo il rilascio dal ribosoma, l’abbondanza di una proteina dipende dall’equilibrio tra la sua produzione e la sua rimozione. Le emivite variano ampiamente: componenti strutturali relativamente stabili possono persistere per mesi, mentre regolatori del ciclo cellulare o enzimi metabolici possono essere rinnovati in minuti o ore. Tale diversità è orchestrata da vie proteolitiche che eliminano selettivamente proteine danneggiate, mal ripiegate o a vita breve, restituendo amminoacidi riutilizzabili.

Nelle cellule eucariotiche, la degradazione mirata è affidata principalmente ai proteasomi, complessi multiproteici presenti nel citosol e nel nucleo. Il nucleo catalitico cilindrico racchiude siti attivi proteasici orientati verso la cavità interna; a ciascuna estremità si trova un “opercolo” regolatorio di tipo AAA+ che riconosce i substrati, li srotola utilizzando ATP e li trasloca nel canale dove vengono scissi in oligopeptidi (Figura 03.06-15). L’isolamento topologico dell’attività idrolitica evita la degradazione indiscriminata delle proteine cellulari.

La selettività dipende da un’etichettatura preliminare: i proteasomi riconoscono soprattutto proteine coniugate all’ubiquitina, una piccola proteina che può formare catene su residui specifici (Figura 03.06-16). L’assemblaggio della catena avviene tramite una cascata enzimatica coordinata (E1–attivazione, E2–conjugazione, E3–ligasi), che conferisce specificità verso insiemi di substrati. Catene di tipo K48 sono il segnale canonico per la degradazione, mentre altre topologie (p.es. K63) possono veicolare funzioni non proteolitiche.

Le proteine destinate a vita breve espongono spesso “degroni” riconoscibili dal sistema ubiquitina–proteasoma. Tra i determinanti:

• una sequenza N-terminale subottimale secondo la regola dell’N-end, che promuove un rapido riconoscimento;
• regioni ricche in Pro–Glu–Ser–Thr (PEST), correlate a rapida turnover;
• elementi idrofobici o domini normalmente sepolti che diventano accessibili in proteine mal ripiegate;
• modifiche ossidative o altre alterazioni chimiche che creano motivi di aggancio per ligasi E3 specifiche.

Le vie proteolitiche, oltre a mantenere la qualità del proteoma prevenendo aggregazioni potenzialmente citotossiche, consentono alla cellula di rimodulare con precisione i livelli proteici in risposta a segnali intra- ed extracellulari.

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Degradazione delle proteine da parte del proteasoma

Le proteine vengono degradate dal proteasoma. Le strutture mostrate qui sono state determinate tramite cristallografia a raggi X. (A) Spaccato della struttura del cilindro centrale del proteasoma, con i siti attivi delle proteasi indicati da punti rossi. (B) Struttura del proteasoma intero, in cui al cilindro centrale (in giallo) sono apposti due coperchi, uno per parte (in blu).

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Degradazione mediata da poliubiquitina

Le proteine marcate da una catena di poliubiquitina vengono degradate dal proteasoma. Le proteine nell’opercolo di un proteasoma (in blu) riconoscono le proteine target marcate da un tipo specifico di catena di poliubiquitina (in rosso). L’opercolo srotola poi la proteina bersaglio e la ricompone nel cilindro centrale del proteasoma (in giallo), rivestito da proteasi che tagliano le proteine a pezzi.

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La produzione di una proteina funzionale implica una catena di eventi coordinati. Negli eucarioti, l’mRNA deve essere trascritto, processato ed esportato nel citoplasma, dove viene tradotto. La catena nascente deve poi assumere la conformazione nativa corretta: alcune proteine si ripiegano co-traduzionalmente, mentre molte richiedono l’assistenza di chaperoni molecolari che prevengono interazioni improprie e favoriscono il superamento di barriere conformazionali.

Oltre al ripiegamento, sono frequenti trasformazioni post-traduzionali che modulano attività, stabilità e localizzazione (Figura 03.06-17). Tra gli interventi di maggiore rilievo:

• modificazioni covalenti reversibili, come fosforilazioni o acetilazioni, che regolano allosteria e interazioni;
• glicosilazioni e altre glico-modifiche essenziali per il traffico e la funzione di molte proteine di membrana e secretorie;
• lipidazioni e ancoraggi a membrane che determinano il microambiente funzionale;
• clivaggi proteolitici attivanti che generano isoforme mature a partire da precursori;
• legame di cofattori e assemblaggio in complessi multiproteici, necessari per l’attività catalitica o regolatoria.

La distribuzione subcellulare dipende da segnali di smistamento (p.es. peptidi segnale per il reticolo endoplasmatico, sequenze di localizzazione nucleare) e da vie di trasporto dedicate (Figura 03.06-18). L’esito finale — una proteina attiva nella sede corretta — risulta dalla sincronizzazione accurata di questi passaggi.

Sebbene la regolazione possa in principio intervenire a ogni livello, nella maggior parte dei sistemi cellulari il controllo principale delle concentrazioni proteiche è esercitato a monte, all’avvio della trascrizione, con modulazioni ulteriori lungo le fasi post-trascrizionali e post-traduzionali.

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Modifiche post-traduzionali delle proteine

Molte proteine richiedono modifiche post-traduzionali per diventare totalmente funzionanti. Per funzionare nella cellula, un polipeptide completato deve assumere la sua conformazione tridimensionale perfetta, legare in modo non covalente eventuali cofattori necessari (in rosso) e aggregarsi con eventuali partner proteici. Per essere attive molte proteine richiedono anche apposite modifiche covalenti oppure devono essere reclutate da membrane o organuli specifici (non mostrati). Sebbene la fosforilazione e la glicosilazione siano le modifiche covalenti più frequenti, se ne conoscono oltre 100 tipi diversi.

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Produzione e regolazione delle proteine negli eucarioti

Nella cellula eucariote la produzione di una proteina avviene in più fasi. La concentrazione finale di ogni proteina dipende dall’efficienza di ciascuna delle fasi qui illustrate. Anche quando un mRNA e la sua proteina corrispondente sono stati prodotti, la loro concentrazione può essere regolata tramite degradazione.

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