L’assorbimento di radiazione elettromagnetica, in particolare nell’intervallo del visibile, dipende dalla possibilità che gli elettroni, localizzati in orbitali atomici o molecolari, compiano transizioni fra livelli energetici discreti. A ciascuna transizione è associata l’assimilazione di un fotone di energia \(E = h\nu\), con \(h\) costante di Planck \(h = 6,6 \times 10^{-34}\ \text{J s}\) e \(\nu\) frequenza della radiazione. La risposta spettrale di una sostanza varia con la lunghezza d’onda \(\lambda\) e costituisce una sorta di “impronta digitale” elettronica.

Per quantificare l’attenuazione del fascio luminoso all’attraversamento di un mezzo di spessore \(x\), si introduce la trasmittanza \(D(\lambda, x)\), definita come rapporto fra l’intensità trasmessa \(I(x)\) e l’intensità incidente \(I_0\). In un mezzo omogeneo e non diffusivo, la legge di attenuazione è esponenziale:

\[ D(\lambda, x) = \frac{I(x)}{I_o} = e^{-\kappa(\lambda)x} \]

dove \(\kappa(\lambda)\) è la costante di estinzione, con dimensioni di cm⁻¹, che sintetizza la probabilità di assorbimento per unità di percorso ottico. In ambito analitico si usa spesso l’assorbanza \(A(\lambda, x)\), definita come \(A = -\log_{10} D\), che, per soluzioni diluite, obbedisce alla legge di Beer-Lambert:

\[ A(\lambda) = \varepsilon(\lambda)\, c\, x, \qquad \kappa(\lambda) = \ln(10)\,\varepsilon(\lambda)\, c, \]

dove \(\varepsilon(\lambda)\) è l’estinzione molare (L mol⁻¹ cm⁻¹), \(c\) la concentrazione (mol L⁻¹) e \(x\) il cammino ottico (cm). La linearità vale in assenza di interazioni fra specie assorbenti e per assorbanze moderate.

La determinazione sperimentale della trasmittanza si esegue con uno spettrofotometro, rappresentato schematicamente in (Figura 07.43-01). Lo strumento, impiegabile nel visibile ma anche nell’UV e nell’IR, isola bande strette di lunghezze d’onda grazie alla dispersione ottenuta con un prisma. In un’architettura tipica si distinguono:

• sorgente di radiazione adatta alla regione spettrale (per esempio lampada al tungsteno per il visibile);
• dispositivo disperdente, nel caso in (Figura 07.43-01) un prisma che seleziona la \(\lambda\) desiderata;
• cuvetta contenente il campione, con percorso ottico noto;
• rivelatore che trasforma l’intensità luminosa in segnale elettrico e sistema di lettura della trasmittanza o dell’assorbanza.

Atomi, molecole, complessi o ioni presenti nella cuvetta assorbono in intervalli specifici di \(\lambda\); la forma e la posizione delle bande permettono l’identificazione. La (Figura 07.43-02) riporta lo spettro di assorbimento dell’acido stearico: lo stato fisico (solido o liquido) modula profilo e ampiezza delle bande, ma gli elementi caratteristici rimangono riconoscibili.

Modifiche della struttura chimica o dello stato di legame alterano il panorama spettrale. Un caso paradigmatico è l’emoglobina, il cui spettro differisce in modo netto tra la forma ossigenata (ossiemoglobina) e la forma deossigenata (Figura 07.43-03). Tale differenza spiega perché il sangue arterioso appare rosso vivo, mentre quello venoso mostra una tonalità più bluastra per via della minore riflessione nelle lunghezze d’onda del rosso.

La misura non invasiva della quota di ossiemoglobina in un distretto vascolarizzato, come il lobo dell’orecchio, è alla base dell’ossimetria: l’assorbimento a due lunghezze d’onda scelte in modo da discriminare ossiemoglobina e deossiemoglobina consente di stimare l’indice di saturazione in ossigeno, parametro funzionale dell’efficienza cardiorespiratoria. In condizioni operative appropriate, la stima si fonda sul confronto tra trasmittanze pulsate attraverso il tessuto, minimizzando l’influenza delle componenti statiche.

Esempio numerico: per una soluzione con \(\varepsilon( \lambda ) = 15\,000\ \text{L mol}^{-1}\ \text{cm}^{-1}\), \(c = 2,0 \times 10^{-5}\ \text{mol L}^{-1}\) e \(x = 1,0\ \text{cm}\), si ottiene \(A = 0,30\) e dunque \(D = 10^{-A} \approx 0,50\); in termini esponenziali, \(\kappa x = \ln(10)\,A \approx 0,69\), in accordo con la relazione \(D = e^{-\kappa x}\).

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Spettrofotometro

Schema ottico di uno spettrofotometro. La luce bianca, emessa da una lampada a incandescenza, viene concentrata da un condensatore sulla fessura d’ingresso D₁, poi passa attraverso un collimatore e arriva come fascio parallelo sul prisma, dove viene dispersa e infine raccolta da un’altra lente. La fessura d’uscita D₂ seleziona un campo spettrale ristretto, che una lente rende parallelo prima che attraversi la cuvetta contenente la soluzione di cui si vuole misurare l’assorbimento. Una lente, infine, raccoglie la luce e la trasmette a una fotocellula che ne misura l’intensità. Variando il campo spettrale tramite D₂ si ottiene la curva di trasmittanza attraverso la soluzione.

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Spettrofotometro

Schema ottico di uno spettrofotometro. La luce bianca, emessa da una lampada a incandescenza, viene concentrata da un condensatore sulla fessura d’ingresso D₁, poi passa attraverso un collimatore e arriva come fascio parallelo sul prisma, dove viene dispersa e infine raccolta da un’altra lente. La fessura d’uscita D₂ seleziona un campo spettrale ristretto, che una lente rende parallelo prima che attraversi la cuvetta contenente la soluzione di cui si vuole misurare l’assorbimento. Una lente, infine, raccoglie la luce e la trasmette a una fotocellula che ne misura l’intensità. Variando il campo spettrale tramite D₂ si ottiene la curva di trasmittanza attraverso la soluzione.

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Curve di trasmittanza dell’acido stearico

Curve di trasmittanza dell’acido stearico per un dato valore di spessore attraversato, allo stato cristallino (a) e allo stato fuso (b). In entrambi i casi le curve presentano caratteristiche assai simili.

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Spettro di assorbimento dell’emoglobina

Spettro d’assorbimento dell’emoglobina (Hb) e dell’ossiemoglobina (O₂-Hb). Il sangue venoso, contenente emoglobina priva di ossigeno (Hb), assorbe maggiormente nel rosso rispetto al sangue arterioso contenente O₂-Hb, per cui, illuminato da luce bianca, appare di colore bluastro. Quando l’ossigeno si lega al gruppo eme dell’Hb, che si trasforma in O₂-Hb, il sangue appare rosso. A 660 nm la differenza tra le curve è massima. A questa lunghezza d’onda, dividendo l’intervallo tra i coefficienti di estinzione in 100 parti, si ottiene la saturazione percentuale di O₂ nel sangue.

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